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Nature 深度剖析:管坤良与 Alj 组研究成果为何截然相反,Hippo 通路调控乳腺癌的两面性

丁香学术

作者|韬  来源|丁香学术(ID:dingxiangshiyan)

乳腺癌是当今女性中最常见的恶性肿瘤,对女性健康存在重大威胁。雌激素受体(ERα)驱动了相当一部分乳腺癌的进展,对于这部分乳腺癌,靶向 ERα 或雌激素合成的内分泌疗法是重要的治疗手段。然而,相当多的患者仍会出现复发及耐药的现象 [1]。因此,探究 ERα 在乳腺癌中的表达调控机制具有重要科学意义及转化价值。

2017 年一篇发表于 Nature 的报道指出,抑癌通路 Hippo 可以介导 ERα 的降解,进而调控 ER + 乳腺癌对内分泌疗法的敏感性。然而,近日 Hippo 领域大牛管坤良组却对此提出了截然相反的结论 —— Hippo 通路反而促进 ERα 的表达。

到底是什么使得这两篇文章产生了如此大的差异呢?

作为重要的抑癌通路和明星级研究热点,Hippo 通路不仅在器官发育、尺寸控制和组织再生中起重要作用,更与多种癌症的进展密切相关。在 Hippo 通路中,激酶 MST1/2 在辅因子 MOB1 和 SAV1 的帮助下,磷酸化活化激酶 LATS1/2,后者进一步磷酸化转录激活因子 YAP/TAZ,使其滞留在细胞质中并降解。当 Hippo 通路上游信号减弱或丢失时,YAP/TAZ 磷酸化水平降低,发生核转位,结合转录因子 TEAD1-4,调控一系列下游基因的表达。

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哺乳动物 Hippo 通路示意图 [2]

Hippo 通路的失调常见于多种肿瘤,YAP/TAZ 的异常活化不仅促进肿瘤发生,更调控上皮 - 间质转化(EMT)、肿瘤干细胞干性维持、对化疗和多种靶向疗法的耐药、免疫逃逸等肿瘤病理过程 [2,3]。业已发现,在 ER + 乳腺癌中,Hippo 通路的失活使 YAP/TAZ 活化并上调 CDK4/6 的表达,从而介导对 CDK4/6 靶向药的耐药性 [4]。

阐明 Hippo 通路对 ERα 的调控机制,对深入了解 ER + 乳腺癌的进展机制及寻找新的潜在治疗靶点具有重要意义。

2017 年,来自瑞士 Friedrich Miescher Institute 的 Mohamed Bentires-Alj 团队于 Nature 发表题为 The Hippo kinases LATS1 and 2 control human breast cell fate via crosstalk with ERα 的文章,报道了 Hippo 通路中的 抑癌激酶 LATS1/2 通过调控 ERα 及 YAP/TAZ 的降解,决定原始乳腺上皮细胞(PHBECs)的分化,及 ER + 乳腺癌细胞对内分泌治疗的敏感性。

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图片来源:Nature

作者发现,抑制 LATS1/2 的表达促使 PHBECs 往腔面型(Luminal)方向分化,产生具有强自我更新能力(self-renewal)的腔面谱系细胞。在机制上,LATS1/2 可以通过结合 ERα 并募集泛素连接酶底物受体 DCAF1/DCAF13,通过泛素 - 蛋白酶体途径诱导 ERα 的降解,且这一过程不依赖其激酶活性或 YAP/TAZ 蛋白。

基于此,作者进一步发现,敲降 LATS1/2 增加了 MCF-7 等腔面型乳腺癌细胞中 ERα 的稳定性,使癌细胞耐受内分泌治疗药物氟维司群(Fulvestrant, 可诱导 ERα 降解),但不影响 ERα 拮抗剂他莫昔芬(Tamoxifen)的疗效。

但出乎预料的是,2021 年 3 月 3 日,Hippo 领域大牛,来自美国加州大学圣地亚哥分校的管坤良课题组于 Nature 以 Matters arising 的形式发表题为 Hippo signalling maintains ER expression and ER+ breast cancer growth 的文章,提出了与上文结果截然相反的结论 —— 抑癌激酶 LATS1/2 反而促进 ESR1(ERα 编码基因)的表达,从而驱动 ER + 乳腺癌的发展。

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图片来源:Nature

本文作者首先通过 CRISPR 同时敲除了 MCF-7 细胞中的 LATS1/2,然而意外的是,细胞生长竟然停滞了,且 ESR1 mRNA 水平和 ERα 蛋白水平大幅下降。

但 Alj 组文章中,LATS1/2 仅在蛋白水平上降解 ERα,在癌细胞系 T47D 中敲降 LATS1 不影响 ESR1 mRNA 水平(Extended Fig 8b)。

考虑到方法的不同,作者采用了上文作者使用的 shRNA 敲降 LATS1/2,但发现敲降 LATS1/2 既不影响 ERα 水平,也不活化 YAP/TAZ。作者猜测,可能是残余的 LATS1/2 的量仍足以抑制 YAP/TAZ 活化。

此外,在其它 ER + 乳腺癌细胞系,及小鼠的输卵管、乳腺和子宫内膜类器官(organoids)模型中,敲除 LATS1/2 均可抑制 ESR1 的表达。另一方面,在 MCF-7 细胞中过表达 LATS1 或其激酶缺失突变体,对 ERα 的蛋白水平没有影响。

进一步,作者通过构建不同突变体,发现 LATS1/2 对 ESR1 mRNA 水平的维持既依赖于其激酶活性,又需要 YAP/TAZ 蛋白的参与,并且在敲除 LATS1/2 后进一步敲除 YAP/TAZ,可以完全挽救 ESR1 表达,表明 LATS1/2 很有可能是通过抑制 YAP/TAZ 的活化,从而维持 ESR1 基因的表达。但 YAP/TAZ 如何抑制 ESR1 基因转录则尚不明确。

在表型层面上,LATS1/2 双敲除 MCF-7 细胞增殖减弱,在荷瘤小鼠中生长缓慢,对 ERα 抑制剂 4 - 羟基 - 他莫昔芬(4OHT)不敏感,且在其中过表达 ERα,可以挽救其克隆形成能力。这一结果说明,LATS1/2 的缺失降低了 ERα 表达量,从而抑制了 MCF-7 细胞的生长。

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LATS1/2 敲除减缓 MCF-7 细胞生长

综上所述,尽管机制不尽相同,但管组的这篇文章与 2017 年这篇 Nature 的大部分结果相悖。那么,原文的作者又作何回应呢?

2021 年 3 月 3 日,Mohamed Bentires-Alj 课题组于 Nature 发表回应,提出了可能导致双方如此迥异的实验结果的原因:

1. 第一个焦点集中于使用 CRISPR 敲除和 shRNA 敲低 LATS1/2 所带来的差异。Bentires-Alj 组发现,shRNA 载体慢病毒高滴度感染细胞会迟滞其生长,但根据原文结果,LATS1/2 表达量应该与 ERα 表达量负相关,降低 LATS1/2 表达量应该会使细胞生长加快。这表明中等程度的降低 LATS1/2 的表达量和大幅降低乃至敲除 LATS1/2,可能会造成不同实验结果。作者猜测,敲除 LATS1/2 带来的 YAP/TAZ 异常持续活化可能对细胞状态有较大的改变,从而使细胞启动某些不为人知的代偿通路以维持稳态,从而改变了 Hippo 通路对 ERα 的调控模式。此外,在 LATS1/2 过表达实验中,Alj 组使用的是瞬间转染,而管组使用的是稳定转染,作者认为这或许会带来一定差异。

2. 其次,双方使用的细胞培养条件有部分不同。Bentires-Alj 组使用的是 M5 培养基培养 PHBECs 和 MCF10A 细胞,鉴于这一培养基可以维持乳腺上皮细胞的增殖和分化,其对 ERα 及相关因子的影响可能与 DMEM 等标准培养基不同。

此外,虽然双方均使用了 MCF-7 细胞系,但由于癌细胞的高度异质性和基因组不稳定性,或许双方实验室的细胞是不同的亚克隆,在生理生化性质上其实有较大差异。

3. 作者认为,双方报道的机制也许都是真实的,可能只是 Hippo 通路对 ERα 在不同条件下的正向和负向调控。并且可能与不同的 Hippo 通路上游信号有关(见本推送图 1)。作者提出,管组文章 Fig 1-o 中,敲除 LATS1/2 彻底消除了 ERα 的表达,但只敲除 YAP/TAZ,ERα 的表达量只是稍微上调,说明 ERα 的表达调控可能存在更复杂的机制。

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敲除 LATS1/2 和(或)YAP/TAZ 对 ERα 表达的影响

笔者认为,Alj 组的回应在一定程度上是有道理的,但尚不足以完全解释两篇文章的差异。Alj 组的原文中,在 PHBECs 中敲降 LATS1/2 后,并未产生典型的 YAP/TAZ 靶基因转录谱(Extended Fig 3),且 ESR1 mRNA 水平上调(Fig 4a)。说明 PHBECs 中,YAP/TAZ 的调控机制与乳腺癌细胞中或许不同,可能源于 YAP/TAZ 的不同翻译后修饰或辅因子,从而对 ESR1 的转录产生不同的调控效应。

但是,Alj 组在 MCF-7、T47D 等乳腺癌细胞中的表型实验,和蛋白水平的机制实验(Fig 4b-e, Extended Fig 8, Fig 9),也都得到了支持其结论的结果。当然,这并不能说明 Alj 组的结论一定不可靠,其蛋白机制部分的实验还亟需验证。同时,管组报道的结果也只是表型实验居多,也需要更深入的机制探究。

除上文外,其它文献亦报道了 Hippo 与 ERα 的关系。YAP1/TEAD4 可以作为 ERα 的辅因子,促进 ERα 相关增强子的激活,从而促进 ERα 下游信号通路的激活及 ER + 乳腺癌的进展 [5]。ERα 亦对 Hippo 通路有影响:ER + 乳腺癌中,CRABP2 可以结合 LATS1 并抑制其泛素化降解,从而抑制 YAP/TAZ 的核转位;但 ER - 乳腺癌中,CRABP2 反而促进 LATS1 泛素化降解,促进 YAP/TAZ 的活化,但具体机制尚不明确 [6]。这些研究成果说明,ER + 乳腺癌细胞中 ERα 与 Hippo 间可能存在精密的反馈调控机制,并受到 CRABP2 等辅因子的调节,从而一定程度上造成了上述两文结论的差异。

总而言之,真理是越辩越明的。笔者真心希望,不论最终结果如何,这一争鸣都能加深人类对乳腺癌、雌激素受体与 Hippo 通路的认识,为新的靶向疗法的开发添砖加瓦,最终造福广大患者。

原文链接:

Alj 组原文:http://www.nature.com/articles/nature20829

管坤良组原文:http://www.nature.com/articles/s41586-020-03131-5

Alj 组回应:http://www.nature.com/articles/s41586-020-03132-4

参考文献:

[1] Pepermans RA, Prossnitz ER. ERα-targeted endocrine therapy, resistance and the role of GPER. Steroids. 2019;152:108493. doi:10.1016/j.steroids.2019.108493

[2] Zheng Y, Pan D. The Hippo Signaling Pathway in Development and Disease. Dev Cell. 2019;50(3):264-282. doi:10.1016/j.devcel.2019.06.003

[3] Wu Y, Li M, Lin J, Hu C. Hippo/TEAD4 signaling pathway as a potential target for the treatment of breast cancer. Oncol Lett. 2021;21(4):313. doi:10.3892/ol.2021.12574

[4] Li Z, Razavi P, Li Q, et al. Loss of the FAT1 Tumor Suppressor Promotes Resistance to CDK4/6 Inhibitors via the Hippo Pathway. Cancer Cell. 2018;34(6):893-905.e8. doi:10.1016/j.ccell.2018.11.006

[5] Zhu C, Li L, Zhang Z, et al. A Non-canonical Role of YAP/TEAD Is Required for Activation of Estrogen-Regulated Enhancers in Breast Cancer. Mol Cell. 2019;75(4):791-806.e8. doi:10.1016/j.molcel.2019.06.010

[6] Feng X, Zhang M, Wang B, et al. CRABP2 regulates invasion and metastasis of breast cancer through hippo pathway dependent on ER status. J Exp Clin Cancer Res. 2019;38(1):361. Published 2019 Aug 16. doi:10.1186/s13046-019-1345-2

编者按:本文转载自微信公众号:丁香学术(ID:dingxiangshiyan)


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